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本试剂盒适用于抗凝全血、组织、细胞、鼠尾、细菌等基因组DNA。采用独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞，利用硅胶膜离心柱特异地吸附DNA，无需酚氯仿等有毒试剂，也无需进行耗时的醇类沉淀，最大限度的去除蛋白及其他抑制性杂质。适用于从多种材料(全血、动物组织细胞、鼠尾、大肠杆菌等)中高效地提取基因组DNA。提取的DNA可直接用于酶切、PCR、Southern Blot、病毒检测等实验。

• 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要耗时的乙醇沉淀等。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量200μL全血可提取出3～6μg基因组DNA。OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达30～50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
  
• 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方，裂解快速完全。

• 裂解液TL、结合液CB、或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
  
• 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，- 20℃保存2年。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机。
  
• 需要自备乙醇，异丙醇，1×PBS (磷酸盐缓冲液，可选)，RNase A（可选）溶菌酶（用于革兰氏阳性菌，可选）。
  
• 不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。
  
• 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
  
• 为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本，不要使用反复冻融超过3次的标本，否则会严重降低产量。

• 全血样本
  
  • 取200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入1.5mL离心管。
    
    • 如果全血起始量小于200μL，则用1×PBS补足到200μL。如果起始量介于200～300μL之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μL～1mL之间，则需要先进行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。
      
    • 如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量仅用5～20μL，可加1×PBS补足到200μL后进行后续步骤。
  • 加入20μL蛋白酶K溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。
    可选步骤，一般不需要：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μL结合液CB前加5μL RNase A (100mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5～10min。
    
  • 冷却后加100μL异丙醇（也可以用无水乙醇替代，以下同），立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
    
    • 上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15sec混匀。
  • 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
    
  • 接操作步骤项下6。
• 组织培养细胞样本
  
  • 收集约10⁵～10⁶悬浮细胞到一个1.5mL离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
    
  • 13000rpm离心10sec，使细胞沉淀下来。吸弃上清，留下细胞团。
    
  • 加200μL 1×PBS重悬洗涤细胞，13000rpm离心10sec，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，将细胞沉淀重悬于180μL 1×PBS中。
    
  • 加入20μL蛋白酶K溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。
    可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μL结合液CB前加5μL RNase A (100mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5～10min。
    
  • 冷却后加100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
    
  • 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
    
  • 接操作步骤项下6。
• 动植物组织（例如鼠肝脑或者植物叶片）
  
  • 将20～50mg新鲜或者解冻的组织用解剖刀切成小碎块（切成小块可以提高产量）或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有180μL组织裂解液TL的1.5mL离心管中，用大口径枪头吹打混匀。
    
  • 加入20μL蛋白酶K，立刻涡旋振荡充分混匀。
    
  • 将裂解物放置在55℃水浴1～3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
    
    • 可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤c后加5μL RNase A (100mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5～10min。
  • 加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10min。
    
  • 冷却后加100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
    
  • 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
    
    • 如果有不溶组织物可能堵住吸头，可将吸头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将吸头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱。
  • 接操作步骤项下6。
• 动物组织样本（例如鼠尾）
  
  • 将0.2 - 0.5cm的鼠尾巴尖(即20～50mg)剪碎（一定要剪0 - 2cm范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好），或者在液氮中研磨成细粉后，转入装有180μL组织裂解液TL的1.5mL离心管中，用大口径枪头吹打混匀。
    
  • 加入20μL蛋白酶K，立刻涡旋振荡充分混匀。
    
  • 将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。
    
    • 可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可在完成步骤c后加5μL RNase A (100mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5～10min。
  • 可选做：用剪大口径的吸头抽打裂解物2～3次帮助裂解。
    
  • 加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。
    
  • 13000rpm离心5min，将上清加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
    
  • 接操作步骤项下6。
    
    • 上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15sec混匀。
• 细菌样本
  
  • 取0.5～2mL培养菌液（最多不超过2×10⁹个细胞），10000rpm，离心30sec，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
    
    • 起始处理量可以根据细菌密度、细胞种类、预期产量进行调整，但是离心吸附柱最大吸附能力是30μg基因组DNA，如果菌体过量超过最大吸附能力，反而会严重降低产量。
  • 加入200μL 1×PBS重悬，10000rpm离心30sec，吸弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μL 1×PBS中。
    
    • 对于较难破壁的革兰氏阳性菌，可略过b步骤，加入溶菌酶进行破壁处理，具体方法为：加入180μL缓冲液(20mM Tris,pH8.0；2mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；临用前加入终浓度为20mg/mL的溶菌酶(溶菌酶必须用溶菌酶干粉溶解在缓冲液中进行配制，否则会导致溶菌酶无活性))，37℃处理30min以上。
  • 加入20μL蛋白酶K溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。
    可选做步骤：如果RNA残留较多，需要去除RNA，可以在加入200μL结合液CB前加5μL RNase A (100mg/mL)溶液，振荡混匀，室温放置5～10min。
    
  • 冷却后加100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
    
  • 将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
    
  • 接操作步骤项下6。
• 加入500μL抑制物去除液IR，13000rpm离心30sec，弃废液。
  
• 加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13000rpm离心30sec，弃废液。
  
• 重复步骤7一遍。
  
• 将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在80～100℃水浴中预热可以提高产量），室温放置3～5min，13000rpm离心1min。
  
  • 可将第一次洗脱所得溶液重新加入离心柱中，室温放置2min，13000rpm离心1min。可以提高浓度10%左右。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μL，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
• DNA可以存放在- 20℃，如果要长时间存放，可以放置在-70℃。

• 介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用
  完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。
  
• 使用方法：（临用前才预处理）取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

• 吸取900μL红细胞裂解液到一个1.5mL离心管或者3mL红细胞裂解液到一个15mL离心管。
  
  • 红细胞裂解液可向本公司购买。
• 将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取300μL全血和1mL全血分别加到上述1.5mL和15mL离心管中，颠倒6～8次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
  
• 室温放置10min。
  
  • 期间应该颠倒轻弹混匀数次，帮助裂解红细胞。
• 13000rpm离心20sec（对于1.5mL离心管）或2000～3000rpm离心5min（对于15mL离心管），倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μL的残留上清。
  
  • 离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复3、4。
• 加入200μL 1×PBS涡旋振荡重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
  
  • 其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬，影响后续实验裂解效果，建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
• 现在可以按照操作提取全血基因组DNA了。